紫外可見分光光度法檢測(cè) 蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留
1 前言
在蔬菜生長(zhǎng)過程中，有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)蔬菜上的多種害蟲均有較好的防效作用。但是，殘留在蔬菜或水果中的農(nóng)藥進(jìn)入到有機(jī)體內(nèi)具有積累效果，會(huì)對(duì)生物體內(nèi)膽堿酯酶具有抑制作用，使其失去分解乙酰膽堿的能力，造成乙酰膽堿積累，引起神經(jīng)功能紊亂，從而導(dǎo)致肌體的損害。現(xiàn)在比較成熟的理化檢測(cè)方法一般步驟復(fù)雜，所用時(shí)間長(zhǎng)，且儀器昂貴。分光光度儀通過農(nóng)藥對(duì)酶的抑制可檢測(cè)出農(nóng)藥殘留是否在合格范圍內(nèi)，具有簡(jiǎn)單、快速、成本低等特點(diǎn)。
2 儀器與試劑
2.1 儀器
Hanon i2可見分光光度計(jì)，天平。
2.2 試劑
pH8.0緩沖溶液：分別取11.9g無水磷酸氫二鉀與3.2g磷酸二氫鉀，用1000mL蒸餾水溶解。
顯色劑：分別取160mg硫代乙酰膽堿，加3.0mL蒸餾水溶解，搖勻后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩１４嫫诓怀^兩周。
底物：取25.0mg硫代乙酰膽堿，加3.0mL蒸餾水溶解，搖勻后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩１４嫫诓怀^兩周。
乙酰膽堿酯酶：根據(jù)酶的活性情況，用緩沖溶劑溶解，3min的吸光度變化值ΔA0值應(yīng)控制在0.3以上。搖勻后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫４嫫诓怀^四天。
可選用由以上試劑制備的試劑盒。乙酰膽堿酯酶的ΔA0值應(yīng)控制在0.3以上。
3 實(shí)驗(yàn)方法
在一定條件下，有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)乙酰膽堿酶正常功能有抑制作用，其抑制率與農(nóng)藥的濃度呈正相關(guān)，正常情況下，酶催化神經(jīng)傳導(dǎo)代謝產(chǎn)物（乙酰膽堿）水解，其水解產(chǎn)物與顯色劑反應(yīng)，產(chǎn)生黃色物質(zhì)，用分光光度計(jì)在412nm處測(cè)定吸光度隨時(shí)間的變化值，計(jì)算出抑制率，通過抑制率可以判斷出樣品中是否有高劑量有機(jī)磷和氨基甲酸脂類農(nóng)藥存在。
3.1樣品制備
選取有代表性的蔬菜樣品，沖洗掉表面泥土，剪成1cm左右見方碎片。
取樣品1g左右，放入燒杯或提取瓶中，加入5mL的pH8.0緩沖溶液，振蕩1min~2min，倒出提取液，靜置3min~5min，待用。
3.2 對(duì)照品測(cè)試
先于試管中加入2.5mL緩沖溶液，再加入0.15mL酶液、0.1mL顯色劑，搖勻后于37℃左右的溫度放置15min以上（每批樣品的控制時(shí)間應(yīng)一致）。加入0.1mL底物搖勻，此時(shí)檢液開始顯色反應(yīng)，應(yīng)立即放入儀器比色池中，記錄反應(yīng)3min的吸光度變化值ΔA0。
3.3樣品測(cè)試
先于試管中加入2.5mL樣品提取液，其他操作與對(duì)照溶液測(cè)試相同，記錄反應(yīng)結(jié)果。
4 結(jié)果與討論
4.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
結(jié)果以酶被抑制的程度（抑制率）表示。
4.2 結(jié)論
當(dāng)蔬菜樣品提取液對(duì)酶的抑制率≥50%時(shí)，表示蔬菜中有高劑量有機(jī)磷或氨基甲酸脂類農(nóng)藥存在，樣品為陽(yáng)性結(jié)果。陽(yáng)性結(jié)果的樣品需要重復(fù)檢測(cè)2次以上。
對(duì)陽(yáng)性結(jié)果的樣品，可使用其他方法進(jìn)一步確定具體農(nóng)藥品種和含量。
通過實(shí)驗(yàn)測(cè)得的幾種蔬菜中的酶抑制率均＜50%，在合格范圍內(nèi)，此方法操作簡(jiǎn)單，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)成本。
參考文獻(xiàn)
[1] GB/T 5009.199 蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的快速檢測(cè)[S].
注意事項(xiàng)
對(duì)照溶液和樣品加入酶液和顯色劑后放置的時(shí)間要一致，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。加入0.1mL底物后盡量快速搖勻放入儀器中檢測(cè)吸光度變化值。