凱氏定氮儀用于揮發(fā)性鹽基氮測定研究報告
1 揮發(fā)性鹽基氮
揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）指動物性食品由于酶和細(xì)菌的作用，在腐敗過程中，使蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生氨以及胺類等堿性含氮物質(zhì)。此類物質(zhì)具有揮發(fā)性，其含量越高，表明氨基酸被破壞的越多，特別是蛋氨酸和酪氨酸，因此營養(yǎng)價值大受影響。揮發(fā)性鹽基氮的含量直接反映肉的新鮮程度。國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：一級鮮肉≤15mg/100g，二級鮮肉15-25mg/100g，腐敗肉≥25mg/100g。
2 揮發(fā)性鹽基氮常用檢測方法
2.1 半微量定氮法
蛋白質(zhì)在酶和細(xì)菌的作用下分解后產(chǎn)生堿性含氮物質(zhì)，有氨、伯胺、仲胺等，此類物質(zhì)具有揮發(fā)性，測定時使用高氯酸溶液浸提，在堿性溶液中蒸餾出后，用硼酸吸收液吸收，再以標(biāo)準(zhǔn)滴定酸溶液滴定計算含量。
2.1.1 試劑
氧化鎂混懸液（1%）：稱取1.0g氧化鎂，蒸餾水溶解定容至100mL容量瓶中，搖勻，備用。
40%氫氧化鈉：稱取40gNaOH，蒸餾水溶解定容至100mL容量瓶中，搖勻，備用。
2%硼酸：稱取2g硼酸，蒸餾水溶解定容至100mL容量瓶中，搖勻，備用。
鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.01mol/L）：吸取濃鹽酸0.85ml，定容至1000ml，搖勻。并按GB/T 5009.12003附錄B的方法進行標(biāo)定。
混合指示劑：
2g/L甲基紅乙醇溶液：稱取0.2g甲基紅溶于100mL乙醇中。
1g/L次甲基藍(lán)指示劑：稱取0.1g次甲基藍(lán)溶于乙醇溶液，并定容至100mL容量瓶中。
甲基紅指示劑（2g/L），次甲基藍(lán)指示劑（1g/L），臨時用將上述兩種指示劑等量混合。
2.1.2 儀器
半微量定氮裝置
微量滴定管：最小分度0.01ml
2.1.3 實驗步驟
樣液的制備：將樣品除去脂肪、骨頭及筋腱后，切碎攪勻，稱取10g于錐形瓶中，加100ml水，不時振搖，浸漬30min后過濾，濾液置于冰箱中備用。
蒸餾：預(yù)先將盛有10ml吸收液并加有5-6滴混合指示液的錐形瓶置于冷凝管下端，并使其下端插入錐形瓶內(nèi)吸收的液面下，精密吸取5ml上述樣品濾液于蒸餾器反應(yīng)室內(nèi)，加5ml 1%氧化鎂混懸液，迅速蓋塞，并加水以防漏氣，通入蒸汽，待蒸汽充滿蒸餾器內(nèi)時即關(guān)閉蒸汽出口管，由冷并行管出現(xiàn)第一滴冷凝水開始計時，蒸餾5min即停止。
滴定：吸收液用0.0100N鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液或0.0100N硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，終點呈藍(lán)紫色。同時做試劑空白試驗。
計算：
其中：
X-----樣品中揮發(fā)性鹽基氮的含量，單位為毫克每百克（mg/100g）；
V-----樣品濾液消耗的標(biāo)準(zhǔn)滴定酸的體積，單位為毫升（ml）；
V0-----空白樣品消耗的標(biāo)準(zhǔn)滴定酸的體積，單位為毫升（ml）；
C-----鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度，單位為摩爾每升（mol/L）；
14-----與1.00ml鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（1.00mol/L）相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，單位為毫克（mg）；
m------取樣質(zhì)量，單位為克（g）。
計算結(jié)果保留3位有效數(shù)字。
2.1.4 討論
堿溶液的選擇
目前揮發(fā)性鹽基氮的測定多用于水產(chǎn)品、動物肉和動物源性飼料中。而食品和動物源性飼料多用1%氧化鎂混懸液。氧化鎂的作用一個是提供堿性環(huán)境，另外一個就是可以起到消泡劑的作用。使用氧化鎂生成的氫氧化鎂溶解度很小，可以是防止速度過快，以防止產(chǎn)生的氨氣過快而導(dǎo)致吸收不完全。氧化鎂是弱堿,在它的作用下,只有銨類物質(zhì)才會生成氨被游離出來，從而被蒸汽帶出，被硼酸吸收氫氧化鈉是強堿，會使蛋白質(zhì)發(fā)生水解,釋放出胺類物質(zhì),使得測定結(jié)果大大高于實際值。參照標(biāo)準(zhǔn)SC/T 3032-2007的方法，在水產(chǎn)品的行標(biāo)中是使用氫氧化鈉作為堿性溶液，但總體來講，水產(chǎn)品比肉制品更容易腐敗，切含量比肉制品大，而且揮發(fā)性鹽基氮在水產(chǎn)品中的存在方式可能與肉制品略有不同，因此水產(chǎn)品中推薦使用氫氧化鈉。
指示劑的選擇
標(biāo)準(zhǔn)方法中選用的是甲基紅次甲基藍(lán)混合指示劑，終點顏色由藍(lán)色變藍(lán)紫色。實踐證明人肉眼對這種顏色變化不太敏感，終點不易掌握，誤差較大。而如果改用與之反應(yīng)相同的微量凱氏定氮法中的甲基紅溴甲酚綠混合指示劑，終點顏色又綠色變灰色，反應(yīng)很靈敏，顏色變化明顯，終點易掌握，結(jié)果重現(xiàn)性好。根據(jù)酸堿滴定理論，用強酸來滴定弱堿時，等當(dāng)點時溶液的pH值偏在酸性區(qū)域，故只能選擇在酸性范圍內(nèi)變色的指示劑，甲基紅溴甲酚綠混合指示劑符合這種要求，微量凱氏定氮法滴定反應(yīng)終點時溶液的pH≈5.9左右，而甲基紅溴甲酚綠混合指示劑的變色點在pH≈5.1其等當(dāng)點與滴定終點很接近，因此是合適的。故在指示劑的選用上建議將甲基紅次甲基藍(lán)混合指示劑改為甲基紅溴甲酚綠混合指示劑。
2.2 微量擴散法
原理：揮發(fā)性含氮物質(zhì)在堿性溶液中釋出，在擴散皿中于37℃時揮發(fā)后吸收于吸收液中，用標(biāo)準(zhǔn)酸滴定，計算含量。
2.2.1試劑
飽和碳酸鉀溶液：稱取50g碳酸鉀，加50ml水，微加熱助溶，使用時取上清液。
水溶性膠：稱取10g阿拉伯膠，加10ml水，再加5ml甘油及5g無水碳酸鉀（或無水碳酸鈉），研勻。
吸收液：混合指示液、0.0100N鹽酸或硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，與半微量定氮法相同。
2.2.2 儀器
擴散皿（標(biāo)準(zhǔn)型）：玻璃質(zhì)，內(nèi)外室總直徑61mm，內(nèi)室直徑35mm；外室深度10mm，內(nèi)室深度5mm；外室壁存3mm，內(nèi)室壁存2.5mm，回壁紗厚玻璃蓋，如圖所示，其他型號亦可用。
微量滴定管：最小分度0.01ml。
2.2.3 實驗步驟
將水溶性膠涂于擴散皿的邊緣，在皿中央內(nèi)室加入1ml吸收液及1滴混合指示液。在皿外室一側(cè)加入1.00ml按半微量定氮法制備的樣液，另一側(cè)加入1ml飽和碳酸鉀溶液，注意勿使兩滴接觸，立即蓋好；密封后將皿于桌面上輕輕轉(zhuǎn)動，使樣液與堿液混合。
將擴散皿置于37℃溫箱內(nèi)放置2h，揭去蓋，用0.01N鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液或硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，終點呈藍(lán)紫色。同時做試劑空白試驗。
3 揮發(fā)性鹽基氮檢測技術(shù)的發(fā)展
半微量凱氏定氮法和半微量擴散法均要進行樣品粉碎、肉浸液提取等操作，過程繁瑣、耗時長，難以滿足當(dāng)前肉品快速非破壞性的檢測需求。近年來，經(jīng)過科研人員大量的探索和嘗試，現(xiàn)已研究并建立了許多高效、快速、智能化的檢測方法。
3.1 定氮儀檢測法
有研究人員研究發(fā)現(xiàn)，使用全自動凱氏定氮儀對肉品進行重復(fù)性實驗，結(jié)果顯示揮發(fā)性鹽基氮含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1%，重現(xiàn)性良好。
3.2 分光光度法
樣品通過浸提處理提取揮發(fā)性鹽基氮,與納氏試劑在堿性條件下生成黃至棕色的化合物
，比色定量。
3.3近紅外光譜法
3.4漫反射光譜法
通過奈斯勒試劑處理的分子篩吸收揮發(fā)性鹽基氮,形成NH2Hg2IO固相顯色體,采用漫反射光譜裝置直接測定。
4 海能儀器K9840測定揮發(fā)性鹽基氮應(yīng)用方案
4.1樣品制備
魚，去鱗，去皮，沿背脊取肌肉；蝦，去頭，去殼，取可食肌肉部分；蟹，甲魚等（其他水產(chǎn)品）取可食部分；將樣品切碎備用。稱取上述處理好的試樣10g（精確到0.1mg），無屑稱量紙包好一并投入消化管中。
4.2蒸餾
消化管中加入1gMgO和3ml硅油消泡劑，連接到定氮儀上。參數(shù)設(shè)置氫氧化鈉溶液0ml，稀釋水50ml，硼酸20ml，蒸餾5min，淋洗液10ml。滴定酸為0.1000mol/L硫酸或鹽酸溶液，精確到小數(shù)點后四位。蒸餾結(jié)束后，手工滴定并計算結(jié)果。樣品需做空白實驗。
4.3計算
M-標(biāo)準(zhǔn)酸摩爾濃度（mol/L）
W-樣品質(zhì)量（g）
V0-空白樣滴定標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量（mL）
V-樣品滴定標(biāo)準(zhǔn)酸消耗量（mL），精確到小數(shù)點后四位